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本篇文章给大家谈谈tgi指数是什么,以及哪一瞬间让你后悔买国产车了相关的内容,希望对各位有所帮助,不要忘了收藏本站喔。

tgi指数是什么,哪一瞬间让你后悔买国产车了?

国产车容易生锈,3年后故障就会故障不断,保值率还非常低,奉劝想买国产车的人要三思,只有明白自己想要什么,才能买到适合自己的车。

以上说得这些缺点,都是大家对于国产车错误的认知,我特别理解后悔买错车的人,但是买国产车后悔了,或许不是车的问题,而是别的原因!

为什么我特别理解后悔买国产车的人呢?

答案:导致后悔的不是车,更多的是心态!

文章开头说的3大缺点,其实都和车主的心态有关,心态出现问题了,就算买了宝马、奔驰、奥迪,该后悔的还是会后悔!

其实,很多车主都会后悔买错车,其中在3个瞬间是最容易感到后悔的,接下来我将具体分析,希望给想买车的读者带来有价值的信息。

第一个瞬间,买车时预算不够,嫌弃国产车没面子

国产车这几年的进步是有目共睹的,为了同合资车竞争,在外观、空间、配置上都做到了不惜成本。

以前很多人说国产车外观不好看,不符合国人的审美,等到什么时候外观好看了,才会考虑买国产车。

既然都说外观不好看,国产车企听取了大家的意见,纷纷花重金请来了国外知名设计师。

一汽红旗邀请了前劳斯莱斯设计总监 贾尔斯·泰勒、吉利汽车邀请了前沃尔沃汽车设计副总裁 彼得·霍布里、长城汽车邀请了曾在福特、宝马任职的首席设计师 皮埃尔·勒克莱克、比亚迪邀请前迪总设计师 沃尔夫冈·艾格。

这些设计师原本都是宝马、奥迪、沃尔沃、劳斯莱斯的设计师,其设计的车型价格都在50万元以上,甚至还有上千万的劳斯莱斯,现在全都在给国产车设计外观。

自从这些设计师到了以后,我认为国产车的外观有了质的提升,吉利的水波涟漪成为了“最美中国车”,比亚迪的龙颜让人眼前一亮,长城的坦克300好看到一车难求。

外观好看了,又有人说国产车只是外观好看一些,徒有其表而已,三大件还是不如合资车,什么时候三大件质量好了再买国产车。

要是这么说,显然就有些外行了,同级别中,国产车发动机的扭矩、功率、马力都要优于合资车。

我们以大众途观L和奇瑞瑞虎8为例,两辆车都是2.0T发动机,这样比较非常公平。

奇瑞瑞虎8 2021款 鲲鹏版 390TGI 自动展翅版

指导价:13.19万

发动机:2.0T 254马力 L4

最大功率(kW):187

最大扭矩(N·m):390

大众途观L 2020款 380TSI 自动四驱R-Line 越享版7座

指导价:26.78万

发动机:2.0T 220马力 L4

最大功率(kW):162

最大扭矩(N·m):350

大家发现没有,国产车比合资车价格便宜10多万元,发动机在马力、功率、扭矩都超过了合资车,说明国产车的动力也没用问题。

至于说质量问题,根据J.D.Power发布的《2021中国新车质量研究(IQS)》显示:自主品牌与国际品牌的差距由2020年的10个PP100缩小到了2021年的5个PP100。

很多人可能不知道PP100是什么意思,简单解释一下。

IQS是一套以IQS(Initial Quality Survey)新车质量调查为主,WDI、PDI和VDS为辅,以降低产品故障和提升产品品质为目标的评价方法。

IQS有一套专业的评测方式:车辆售出后三个月内总故障数÷当月销售总量×100=PP100指数

也就是说,自主品牌这么多,质量参差不齐,但是平均质量已经与合资车差不多了,至于说生锈的情况,3年后故障不断,这些都没有了。

而且同价位的合资车与国产车几乎没有差距,甚至还要更好一些。

现在看来同级别车型,国产车外观好看、动力更强、质量表现不错,最重要的是价格便宜很多。

可以说国产车各方面都表现不错了,为什么还有很多人买国产车后悔了呢?

原因就是嫌弃国产车没有面子,我在汽贸店做兼职的时候,见过很多客户,目标是合资车,但是预算不够,最后只能退而求其次选择了国产车。

在这些车主人眼中,国产车的优点是可有可无的,主观意识上认为自主品牌就是品牌力差,只是因为价格便宜才选择了国产车。

根据J.D.Power《2020中国弃选客户研究》显示:在主流车品牌当中,自主品牌的弃选率高达72.3%,远高于排名在第2名的日系品牌。

说得通俗易懂一些,弃选率就是放弃率,在这些人眼中,如果自己预算足够的话,肯定看都不会看一眼国产车。

但是有时候造化弄人,这些人中就有很多预算不足的,想要买一辆空间大的车,可是合资车太贵,只能选择国产车。

买车的时候就比较勉强,这就为“后悔”埋下了种子。

等到国产车回家以后,只要看见有人说国产车不好,或者看见了国产车的负面消息,就会开始后悔。

开车出去遇到了老熟人,看见对方是合资车,内心就会感到自卑,嫌弃国产车没有面子,就会瞬间后悔买了国产车,这就是心态出现了问题,不是国产车本身的问题。

我在刚买比亚迪汽车的时候,也曾出现过这样的心态,担心别人不认可比亚迪,甚至担心别人嘲笑比亚迪车标,后来发现身边的人没有说国产车不好的,甚至还有很多人羡慕的。

在我看来,虽然现在汽车已经很普及了,但是依然有很多人没有汽车,只要自己有车了,就比没有车的人强多了。

现实中很多人没有汽车,骑个自行车都嘲笑有车的人,认为自己能买上BBA,等到自己买车时,或许就知道其中的难处了。

第二个瞬间,国产车出现故障,就会认为是国产车质量差

都说合资车皮实耐用,丰田车开不坏,其实大部分人都没有开过合资车,具体质量如何很多人都不知道,只是大家都说合资车好,出现了人云亦云现象而已。

我开过很多合资车,该出现的故障一个没少,表哥就是修车师傅,每天修的合资车不比国产车少。

上面已经说了,现在的国产车与合资车质量差不多,不会像10年前差距那么大,可是在很多人意识里,合资车就是比国产车质量好。

有这样意识的人,按理说是不会买国产车的,可是不知道是什么样的原因,最后还有小部分人选择了国产车。

这些人买了国产车以后,不出现故障还好,一旦出现故障,瞬间就感到后悔了,特别容易上纲上线,在网上各种吐槽。

比如,电动座椅异响了、屏幕死机了,其实这些问题合资车也有,但是大家特别容易忽视,认为很正常,但是国产车就不行了。

这些人经常说:“你看,国产车质量就是不行,以前开合资车从来都没有遇到过这些问题。”

有时候我就在想,以前的合资车出现问题就奇怪了,在以前能有几辆合资车有电动座椅和车载大屏幕的?没有这些配置,想要出现问题也难呀!

所以说,有时候出现问题的不是国产车,而是车主心态问题,但凡心态平和一些,客观一些,就不会这么容易感到后悔了。

第三个瞬间,保值率低,就会觉得是国产车不好

很多人第一次买车,就是奔着国产车去的,心里知道国产车外观好看、配置丰富、空间大、动力强。

在用车的时候各种满意,打心眼里觉得国产车性价比高,可是等到卖车的时候,突然发现国产车保值率低,二手车竟然不值钱,就会瞬间觉得自己买亏了。

根据全国工商联汽车经销商商会,联合车e估发布的《2020年度汽车保值率报告》日系车第一年保值率为79.81%,德系车第一年为75.28%,分别为保值率第一和第二。

国产车第一年保值率为63.3%,排名倒数第二;法系车保值率排名倒数第一。

要是这么看,确实国产车保值率比较低,和排名第一的日系车相差16个百分点,算下来相差不少钱了。

举个例子,假设都是国产车和日系车落地都是10万元,都是第一年后卖出去,日系车可以卖7.98万元,国产车只能卖6.33万,两车就相差1.65万元了。

从卖出的差价来看,国产车比日系车赔了1.65万元,可实际上真是如此吗?

很多人在买车的时候只知道看优点,在卖车的时候看的就全是缺点了。

我们好像都忽视了一个问题,同样10万元落地,国产车是什么样的空间配置,日系车又是什么样的空间配置?

开车的时候觉得国产车空间大、配置多、动力强,卖车的时候就开始觉得保值率低了,可是平时享受到的一切,这种体验是花1.65万元买不到的呀!

国产车虽然保值率差了一点,但是我们不能忽视了平时享受到的一切,要综合衡量国产车的价值,而不是只看保值率高低。

国产车到底能不能买?

总结一下国产车的3大缺点,相比于合资车,国产车的品牌力低一点、故障率高一点、保值率低一点。

这3大缺点都是硬伤,一时难以改变,但是我们不要忽视了一个问题,就是“价格”因素。

同样的价格,国产车与合资车谁更值得选择,我想大家心里都有数。

在我看来,认可国产车的人就可以买,不认可国产车的人,说得再多也听不进去。

很多人买国产车后悔了,其实就是心态出现了问题,在他们眼中,品牌力大于一切,国产车的优点就是可有可无的,总是忽略了同样的价格,国产车的配置更多、空间更大、动力更强。

如果真的特别在乎品牌力,认为汽车可以带来身份认同感,那么就多花点钱买合资车,不要在买车的时候太将就了,不然就容易感到后悔。

对于一心支持国产车的车主,可以对国产车期待很高,但是不能期待值过高,心态要放平和一些,任何车都不可能是完美的,出现故障是必然的。

买车心态和眼缘都特别重要,买自己第一眼就喜欢的车很重要,这样才能足够地包容汽车出现的问题,不至于经常感到后悔。

哪款SUV性能好又智能的?

预算15万,选择非常非常多,来来来,一波推荐走起。

都是国产车口碑好的,动力和配置实差别都不大,就看你跟谁确认了眼神了,小伙子。

品控高、颜值高、配置高、年轻范儿~~~

汽油版:

哈弗F7

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领克02

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比亚迪唐

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长安CS75 PLUS魏派VV6

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SUV COUPE版:

哈弗F7x

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吉利星越

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长安CS85 COUPE

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荣威RX5MAX外观?

小思看世界,带你了解一下荣威RX5MAX这款车。

汽车领域的白热化主要体现在紧凑型SUV领域,比轿车更加宽敞、更加舒适的体验成为了消费者的选择,比如说大热的长安CS75、哈弗H6、吉利博瑞等,还有就是它的灵活车身也是考虑的重点,现在车位这么紧张,紧凑型车型通过性比较良好。荣威RX5MAX就是其中之一。

强韧美学

荣威RX5MAX整体造型采用了家族化设计语言,在RX5基础之上,颜值有了明显的变化,变得更加刚毅。强韧之中带有优雅,克制之中带有张力。

中网造型比较硬核,大尺寸四幅格栅设计,银色镀铬让人眼前一亮,非常醒目。两侧大灯造型扁平,拉宽车头视觉感受,用"T"型外围格栅进行包围设计,将大灯和中网融为一体。

两腮处的雾灯造型呈对称"C"型结构,方正元素体现荣威RX5MAX的霸气,下格栅用银色镀铬饰条修饰,连续的凸起,增强立体感,扁平的结构犹如大嘴,让车底盘的视觉感受薄化。

车身侧面腰线设计遵循荣威家族的一贯理念,上腰线呈现内凹式,贯穿车头至车尾,位置在门把手连线的上方;中腰线呈现隆起式,从前翼子板到后翼子板,幅度比较宽,就像海岸线一样;下腰线的反光位比较明显,与车门踏板的银色镀铬饰条平行,就像柳叶形状一样。

19英寸风云轮毂承担整车质量,双色轮毂由两种造型镂空组成,看起来动感十足,充满时尚感。只是轮胎和翼子板的距离比较大,显得车身比较高,黑色的轮眉来自于整车底盘包围,突出轮胎的半圆形状。车窗边缘也采用了银色镀铬装饰,看起来十分精致。

星海闪跃交互尾灯采用LED灯珠,不仅提升了照明效果,而且在节能方面的表现也很不错,内部是折线灯丝螺旋造型,点亮时刻就是最显眼的标识,印证着荣威RX5MAX的车辆身份,两侧大灯用一条银色镀铬条连接在一起,构成一个整体。

B级部分豪华

进入车内的第一感觉就是视觉非常明亮,最大的功臣是头顶的I-MAX巨幕级全景天窗,阳光下的荣威RX5MAX熠熠生辉,温暖照拂着心灵;阴雨天的荣威RX5MAX可以遮风挡雨,看着窗外的行人匆匆,回想着那些尘封的往事。

14.3英寸中控屏,2.5D四曲面玻璃大屏,视野清晰,反应灵活,还带有旋钮设置,使用起来轻松便捷。搭配12.3英寸全景AR模式虚拟仪表,真实场景纯真还原,实地感受车辆状况变化。可以看到荣威RX5MAX的双屏尺寸都很大,在同级配置中占据领先地位。

2020款荣威RX5MAX只有一款车型,整车尺寸为4647x1891x1725mm,轴距长为2760mm,后排乘坐空间宽阔,头部和腿部距离保证一拳是没有问题的,后排地板中央有地台,高度不算高,如果是坐大人,应该不影响,如果是坐小孩,还是有帮助作用的。

零压力豪华真皮座椅填充柔软,支撑性和舒适性都不错,中控处的立式Qi无线充电为用户智能充电省去不少麻烦,突出座舱科技感,后备箱空间也很大,3个大尺寸行李箱完全容纳,毫无压力。

除了观感的舒适享受,荣威RX5MAX的智能科技考虑得也很周全,沉浸式立体环绕式音响系统能够达到剧院级静音水准,除了256色自定义氛围灯,还有深紫外线光学杀毒系统,纳米抑菌达到超高水准,360度感知环境,智能驾驶辅助系统随时在线。

写在最后

荣威RX5MAX的刚强性格有自己的底气,内饰的舒适可以达到豪华水准,在B级车身上的部分高级感都已经表现出来,不愧是MAX版本。

关注小思看世界,带你看车的世界。

如何看待2020年1月10日网易云音乐全球电音榜?

直以来,网易云音乐在电音领域的投入与运营,已经为其聚集了大批的电音爱好者。根据艾媒咨询发布的《2016-2017 年度中国电子音乐市场研究报告》(简称报告),在中国电音爱好者在线音乐平台 TGI(Target Group Index,目标群体指数,数额越大,目标群体吻合度越高)中,网易云音乐 TGI 居首,达到 122.2,其电音爱好者占比明显高于行业平均水平。

报告同样显示,在中国受访电音爱好者对在线音乐平台电音专业度感知分布中,网易云音乐评分最高。所以不论是在电音领域的用户数量还是服务质量,网易云音乐都已经走在了许多同类型平台前面。

虽然在中国,电子音乐受到越来越多人喜爱是一种趋势,但网易云音乐在当中起到的传播和推动作用依然不可忽视,还有很多中国电音爱好者称网易云音乐为 " 全国电音迷的大本营 "。那么网易云音乐是如何成为电音爱好者聚集地的呢?

分子鉴定技术发展历程?

分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料,用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常,从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常,以确定受检者有无基因水平的异常变化,对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术,比如PCR技术、基因测序技术等等。

PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,基本原理类似于DNA的天然复制过程,由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性,模板DNA与引物的退火(复性),引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大,通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。

基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生 A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析,使得DNA序列得以清晰。

下面一起来了解一下分子诊断技术近50年的发展历程:

一、基于分子杂交的分子诊断技术

上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。

(一)DNA印迹技术(Southern blot)

Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。

(二)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。

(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。

如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。

(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。

该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。

1.微阵列芯片

(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;

(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。

目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。

二、核酸序列测定

测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。

(一)第1代测序

1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。

Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。

(二)第2代测序

1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。

2.高通量第2代测序

目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。

(三)第3代测序

第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。

三、基于分子构象的分子诊断技术

(一)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。

(二)变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。

(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。

如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。

四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。

(一)实时荧光定量PCR(real-time PCR)

1.双链掺入法

1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。

2.TaqMan探针

由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。Taqman探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-time PCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。

3.分子信标

同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR的方法,分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光;在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。

4.双杂交探针

1997年,Wittwer等[25]发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。

(二)数字PCR

早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。

经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。

五、对未来5年的展望

半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。

在未来5年中,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。

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